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后来他又作了许多相关的实验，随即遇到一个问题，如何提炼单纯的盘尼西林，缺乏这个技术，使他无法继续观察研究，随著磺胺类药物的出现，人们普遍对青霉素的报告不感兴趣。
1935年英国牛津大学病理学系主任弗洛里和旅英的德国生物化学家钱恩合作，研究青霉素的性质、分离和化学结构，解决了青霉素的纯炼问题。后来以弗洛里为首的研发团队从青霉菌中提取出了抗生素青霉素（又名盘尼西林），牛津病理学系主任的哈里斯（Henry Harris）曾说过：「没有弗莱明，不会有钱恩；没有钱恩，不会有弗洛里；没有弗洛里，不会有希特利；没有希特利，则不会有盘尼西林。」
1941年首次于人类测试青霉素；青霉素的发现，完全改变了人类与传染病之间生死搏斗的历史，人类的平均寿命也得以延长。弗莱明因此与钱恩和弗洛里共同获得了1945年诺贝尔医学奖。
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