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柠檬酸合成酶（Citrate synthase，2.3.3.1）几乎存在于所有活细胞中并且是催化三羧酸循环第一步的一个限速酶。此酶存在于真核细胞的线粒体中，但它是由细胞核DNA而非线粒体DNA编码而成；细胞质核糖体合成后，运输到线粒体基质中。
乙酰辅酶A + 草酰乙酸 + H2O → 柠檬酸 + 辅酶A
首先，柠檬酸合成酶的组氨酸残基作为亲核试剂使乙酰辅酶A中甲基去质子化而形成碳负离子，后者亲核攻击草酰乙酸的羰基碳，从而羟醛缩合生成柠檬酰辅酶A，将高能硫酯键水解后即得到柠檬酸。
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