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丁醇可以被用作内燃机的燃料。因为它较长的烃链，导致其对相当非极性，把丁醇和乙醇相比，丁醇更类似于汽油。丁醇已被证明可用于工作于设计使用汽油的汽车而无需修改汽车。它有一个四环烃链。它可以从生物质中被生产（称为“生物丁醇”），以及从化石燃料中被生产（称为“石油丁醇”），但生物丁醇和石油丁醇具有相同的化学性质。
来自生物质的丁醇被称为生物丁醇。 它可用于未改造的汽油发动机。 原料的高成本被认为是防止商业丁醇发酵的主要障碍之一。 使用廉价且丰富的原料，例如玉米秸秆，可以提高工艺的经济可行性。
生物丁醇可以通过丙酮-丁醇-乙醇发酵工艺的生物质发酵来生产。 该工艺使用细菌丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum），也称为魏茨曼生物，或者细菌Clostridium beijerinckii。 这是由于哈伊姆·魏茨曼(Chaim Weizmann)于1916年第一次使用丙酮丁醇梭菌从淀粉中生产丙酮（主要使用丙酮制成线状无烟火药）。丁醇是发酵的副产品（生产丁醇的量是原料的两倍）。 该方法还产生可回收量的H2和许多其他副产物：乙酸，乳酸和丙酸，异丙醇和乙醇。
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